• 細(xì)胞準(zhǔn)備：以適當(dāng)密度接種細(xì)胞，處理。

  
  

• 陽性對照設(shè)置：用線粒體解偶聯(lián)劑（如CCCP， FCCP， 10-50 μM， 處理5-30分鐘）作為陽性對照，可全消除膜電位，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系有效性。

  
  

• 染料裝載：

  
  

• 配制JC-1工作液（用培養(yǎng)基或緩沖液稀釋）。

  
  

• 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入JC-1工作液，37°C避光孵育15-20分鐘。

  
  

• 洗滌：用預(yù)溫的PBS或JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞1-2次。

  
  

• 重懸上機(jī)：用PBS重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測。

  
  

• 流式設(shè)置：用488 nm激光激發(fā)，分別用FL1通道（檢測單體，綠色）和FL2通道（檢測聚合物，紅色）收集熒光。

  
  

注意事項(xiàng)與優(yōu)化

1. 陽性對照是必須的：每次實(shí)驗(yàn)都必須設(shè)置CCCP/FCCP處理組，以確保染料的反應(yīng)性和實(shí)驗(yàn)的有效性。

   
   

2. 嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件：

   
   

• 溫度：所有試劑需預(yù)溫至37°C，避免溫度驟變引起膜電位自發(fā)變化。

  
  

• 時間：染色后應(yīng)盡快檢測，尤其對于凋亡細(xì)胞，膜電位可能在染色過程中持續(xù)下降。

  
  

• 濃度：染料濃度過高會引起自身熒光淬滅或線粒體毒性，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定濃度。